ESTUDIO DE LA DEGRANULACIÓN DE CÉLULAS NK MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE CD107a/b POR CITOMETRÍA DE FLUJO
Resumen
Para la generación de células asesinas activadas por linfocinas (LAK) humanas se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll. Por otro lado, para analizar la degranulación de las células LAK en respuesta al reconocimiento de las células diana se evaluó controlando la expresión del antígeno de superficie de CD107a, presente de forma transitoria en la superficie celular después de la liberación de los gránulos citolíticos. La degranulación se medía mediante citometría de flujo. En los resultados se pudo observar que las células diana K-562 tienen un porcentaje de degranulación mayor que en el caso de MaMel-56 ya que las células K562 no poseen complejos MHC requerido para inhibir la actividad NK. Los receptores de las células MaMel-56 se caracterizan por interactuar con diversos tipos de complejos de histocompatibilidad de clase I (presente en las células LAK), transmitiendo una señal de inhibición de la citotoxicidad que prima sobre la activación. Por otro lado, entre MaMel-56 y esta misma célula diana bloqueada mediante anti-HLA-1 los niveles de degranulación son prácticamente los mismos, que según lo explicado es un resultado incongruente, ya que el receptor de inhibición estaría ocupado y no debería inhibir la citotoxicidad de las células NK, por lo que, entonces, cabe pensar que hay otras señales de inhibición en las células MaMel-56.
Introducción
Las células NK son linfocitos que participan en la respuesta inmune innata. Descritas inicialmente por su capacidad natural para destruir células tumorales in vitro, son primordiales para la lucha contra el cáncer debido a su actividad citotóxica frente a células tumorales. También eliminan células infectadas por virus. En mamíferos representan aproximadamente el 10-15% de linfocitos de la sangre.
La expresión de diferentes marcadores de superficie permite distinguir distintos estadios de diferenciación de las células NK.
Las células NK maduras son exportadas a la periferia y se pueden encontrar en la sangre, órganos linfoides, hígado y pulmón. Se pueden distinguir diferentes poblaciones de células NK maduras por la expresión de diferentes marcadores.
Por ejemplo, en el ser humano se distinguen dos subpoblaciones de células NK dependiendo del nivel de expresión de CD56: CD56 bright ("brillante" función reguladora, secreta citoquinas, Tienen mucha capacidad de expresión del CD56) y CD56 dim (son más maduras y más citotóxicas y tienen baja capacidad de expresión del CD56). Los marcadores que permiten diferenciar a las células NK difieren en función de la especie animal.
Por ello, es importante conocer su funcionamiento, para poder emplearlas como una posible terapia contra la enfermedad. Por ello, en este ensayo se ha medido la degranulación de estas células para determinar su actividad frente a dos líneas celulares (K562 y MaMel-56). Para la obtención de las células NK se empleó una línea celular LAK (lymphokine activated killers), proveniente de donantes sanos.
Hipótesis y objetivos
Hipótesis:
Las células NK participan de forma activa en la eliminación de células cancerígenas, por lo que se utiliza esta premisa para llevar a cabo este estudio. Además, se analizará la importancia de los receptores HLA de tipo 1 en la actividad de las células NK.
Objetivos:
El principal objetivo de este estudio es observar la degranulación de las células LAK frente a las diferentes células diana y así analizar el funcionamiento del sistema inmune innato de forma más detallada. De esta forma se podrá aplicar al desarrollo de terapia frente al cáncer u otras enfermedades autoinmunes, así como aquellas cursadas por infección viral. Otro objetivo es el de encontrar una relación entre la regulación de la actividad de las células NK y los receptores HLA de tipo 1.
Materiales y Métodos
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación de densidad flotante sobre Ficoll, para ello, se diluyó sangre periférica con PBS obteniendo una suspensión celular. 5mL de esa suspensión celular se depositó en 3 mL de Ficoll y se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos. Una vez centrifugado se extrajo la interfase y se completó con PBS hasta 10 mL. Se volvió a centrifugar durante 5 min a 1500 rpm y se resuspendió el pellet, al cual se le añadió 3 mL de PBS para poder realizar el recuento del número de células y la viabilidad. Para ello, se añadió Azul Tripán a la muestra y se cargó en una cámara de Neubauer. El objetivo de este procedimiento fue la separación de la población deseada (células mononucleadas) y el estudio de su viabilidad. stas células se cultivaron durante una semana en medio LAK.
Después de la incubación, se procedió al recuento de células LAK y al de las células diana. Para el ratio E:T 1:1, se resuspendió ambas poblaciones a una misma concentración de medio RPMI1640 completo (cRPMI o RPMIc). Se preparó 4 tubos de citometría con reactivos distintos, necesarios para el estudio, a los que se les añadió células para poder favorecer el contacto celular. Se dejó incubar 5h a 37ºC y 5% de CO2. Para la identificación de las poblaciones se añadió los anticuerpos de superficie (antiCD56 PE y anti-CD3 PerCP) durante 30min. Además se pipeteó en un tubo adicional con células sin marcar los anticuerpos controles isotípicos para la compensación del equipo. Finalmente se lavaron las muestras con PBS+0.02%azida+0.5mM EDTA para disolver los posibles agregados y se llevaron al citómetro para su posterior análisis. Por otro lado, para medir la degranulación de las células LAK en respuesta al reconocimiento de las células diana se evaluó controlando la expresión del antígeno de superficie de CD107a (proteína de membrana asociada a lisosoma-1), un antígeno de superficie presente de forma transitoria en la superficie celular después de la liberación de los gránulos citolíticos. La expresión de CD107a se ha utilizado como un marcador para medir la desgranulación mediante citometría de flujo con un citómetro FACScan.
Resultados:
Se observó que el porcentaje de degranulación más alto era el de las células K562, seguido de las MaMel-56 +anti-HLA-1 puesto que la presencia del anti-HLA-1 permite que esta línea celular tenga un porcentaje de degranulación mayor a las MaMel. En cambio, las MaMel presentan un porcentaje de degranulación menor que el resto, por lo que la actividad citotóxica de las NK están inactivadas.
Sin embargo, se observó grandes diferencias de porcentajes de las mismas células diana entre un grupo y otro esto pudo ser producido por algún error en los volúmenes utilizados o por cualquier contaminación.
Para ver el porcentaje de degranulación basal de las células NK se utilizó el programa Flow Logic. En primer lugar, se partió de células sanguíneas previamente marcadas, se procedió a aislar la población deseada, en este caso, la linfocitaria (Fig 1), a continuación, se seleccionó las células CD3 - CD56+ (Fig 2), y por último, gracias a la expresión del antígeno de superficie de CD107a, presente de forma transitoria en la superficie celular después de la liberación de los gránulos citolítico se evaluó la degranulación de las células NK (Fig 3). El porcentaje de degranulación basal que se obtuvo fue del 10, 43 %.
En el caso de K-562 se observó que aumentó el porcentaje de degranulación, siendo este 38,97 %, por lo que permite la activación de las células NK. Este valor se obtiene restando el porcentaje de degranulación basal (10,43 %) a el porcentaje medido en este caso (49,40 %).
En el caso de la degranulación de células LAK frente a la línea celular MaMel-56 se observa un porcentaje de degranulación muy bajo (4,6 %).
Por último, la degranulación de las LAK frente a Mamel-56 cuyos receptores inhibidores HLA-1 se encuentran ocupados por anti-HLA-1 muestran un 11, 15 %.
Con los resultados estadísticos, se pudo observar que el valor medio más alto es el de K562. Los valores medios de MaMel-56 y Mamel-56 + anti-HLA1 son muy parecidas, lo que muestra que el receptor HLA-1 no es tan importante para la degranulación de NK, ya que su inhibición no provoca un aumento notorio de esta degranulación. Esto se puede combinar con los datos de las combinaciones, en el cual la significancia de la comparación entre estas dos es no significativa.
La comparación entre K562 y Mamel-56 da un p valor de 0,012, el cual es significativo, por lo que se encuentran diferencias entre estos dos valores.
La comparación K562 y MaMel-56 + anti-HLA-1 da un p valor de 0,012, el cual es significativo, por lo que se encuentran diferencias entre estos dos valores.
La comparación de MaMel-56 y MaMel-56 + anti-HLA I da un valor p no significativo (0,079), lo que concuerda con la idea de que los receptores HLA-1 no intervienen en la degranulación de las células LAK, ya que no se encuentran diferencias entre estas dos variantes.
Discusión
En el caso de que los receptores HLA-1 tuvieran una implicación directa en la inhibición de la degranulación de LAK, los resultados de LAK con K562 y LAK con MaMel-56 + anti-HLA-1 deberían ser parecidos. Sin embargo, se ha visto experimentalmente que estos valores difieren numéricamente en gran medida. Esto se apoya en los datos estadísticos obtenidos, por lo que se puede decir que estos receptores no son esenciales para la inhibición de la actividad de LAK.
Comparando con estudios adicionales, se ha llegado a una hipótesis. Las células de melanoma secretan diferentes citoquinas, factores de crecimiento y enzimas como TGF-β, IL-10, PGE2, factor de inhibición de migración de macrófagos (MIF), y la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), la cual se encuentra sobreexpresada en células tumorales. Estas promueven la inmunotolerancia de las células de melanoma. Dentro de este grupo, cabe resaltar la acción inhibitoria de PGE2 y la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), las cuales juegan un rol muy importante en la inmunosupresión.
En concordancia con los resultados de nuestro estudio, no se encontraron diferencias notorias en cuanto a la degranulación de las LAK en presencia de las MaMel-56 y las LAK en presencia de las MaMel-56 + anti-HLA1. Esto demuestra que existen otros factores, como los mencionados anteriormente, que promueven la inmunotolerancia, frenando la degranulación de las LAK aun estando inhibidas a su vez los receptores HLA-1.
Conclusiones
Los receptores HLA-1 no están implicados de forma tan directa en la inactivación de las células NK como se pensaba, sino que hay que tener en cuenta otros factores, en concreto PGE2 y la enzima IDO, que participan en la supervivencia de las células de melanoma en el organismo. Por lo tanto, la inactivación de estos provoca el incremento de la degranulación de células NK frente a células de melanoma, lo cual se puede emplear como terapia contra este tipo de cáncer.
Líneas futuras de investigación
La terapia dirigida a los checkpoints combinada con otras inmunoterapias dirigidas a NK amplía el espectro de la inmunoterapia hacia muchos tipos de tumores que actualmente no responden a las terapias disponibles
Los checkpoints o inhibidores del punto de control permiten la activación del sistema inmunitario y desencadenan un ataque inmunológico contra las células cancerosas. Se ha visto que las células Natural Killer (NK) juegan un papel crucial en la respuesta de los inhibidores del punto de control, demostrando que esta terapia no estaba enfocada únicamente por los los linfocitos T, como se ha pensado durante muchos años.
El estudio se llevó a cabo a partir de varios modelos de cáncer de ratones. Observaron que los inhibidores del punto de control podían reducir los tumores incluso en ratones que no poseían las células T anticancerígenas, por lo que algún otro tipo de célula estaba respondiendo a este mecanismo. Además también demostraron que las células Nk producen las mismas moléculas receptoras del punto de control que las células T, respondiendo de forma directa a los inhibidores del punto de control.
De esta forma se toma más conocimiento sobre todos los posibles mecanismos para poder hacer frente a los distintos tipos de tumores, sabiendo que las células T y NK son capaces de reconocer a estas células y destruirlas, siendo la primera línea de defensa del sistema inmunitario. Se piensa que en un futuro será posible determinar no solo las mutaciones en su cáncer sino también como su sistema inmunológico está interactuando con su cáncer para poder administrar la mejor inmunoterapia al paciente.
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